芸苔素内酯的分离、提纯方法

芸苔素内酯的分离、提纯方法：
将油菜花粉用去离子水洗涤30分钟(每克花粉用4毫升水)，然后过滤，重复洗涤七次。将花粉滤饼进行冷冻干燥，使含水量＜1%；再用异丙醇回流萃取1小时(每克花粉用3毫克异丙醇)，并用豆苗第二节间伸长法测定其活性，直到萃取液的活性很低为止。
然后将萃取液进行真空浓缩，得花粉提取物；再用四氯化碳/甲醇水溶液进行逆流分配萃取，分取上层液(即甲醇—水溶液)进行真空浓缩。
再将浓缩物通过两次硅胶柱层析，分别用苯—甲醇—乙酸(90∶16∶8)及甲醇—氯仿(甲醇浓度10～20%)进行洗脱，用紫外光于400nm进行跟踪，收集有活性的洗脱液，浓缩后即得油菜素。pic
上述获得的油菜素尚含有植物脂质，必须用高效液相色谱仪(μ—BondapakC18，甲醇—水，65∶35)进行精制，用菜豆第二节间伸长法测定其活性。通过上述方法，可从40千克花粉中获得4毫克的油菜素内酯。pic
再用甲醇重结晶，可得结晶的油菜素内酯，熔点274～275℃，分子式C28H48O6。经质谱、红外及X射线晶体分析油菜素内酯的立体结构式。它的化学名称是2α，3α，22α，23α-4羟基-24α甲基-B-同型-7-氧-5α-胆甾烯-6酮。
芸苔素内酯（BR）结构： BR的基本结构是一个甾体核，并在核的C-17位上有一个侧链。根据B环中含氧官能团的性质，可分为内酯型、酮型和脱氧型（还原型）。BR生物活性与结构关系密切。活性BR必须具备如下结构特征：（1）A/B环为反式；（2）B环含有7位内酯和6位酮基；（3）A环上具有2位和3位两个羟基；（4）侧链22位23位具有羟基；（5）侧链24位上有1～2个C的取代基。根据这些特征，目前人工合成了多种BR，如表油菜素内酯(24-epi-brassinolide)、高油菜素内酯(28-homobrassinolide)以及长效芸苔素内酯TS303(丙酰芸苔素内酯)。
现在国内生产的BR品种主要有两种，一种是称为表芸苔素内酯（epi-BL），它在24位上的甲基的构象与BL相反，还有一种称为高芸苔素内酯（homo-BL），它的分子中24-位的甲基改为乙基，这两种芸苔素内酯在自然界均有存在。
长效芸苔素内酯TS303（通用名称丙酰芸苔素内酯）的化学结构上羟基发生了变化，尤其是原来的两个羟基改变成两个丙酰基。 根据B环中含氧功能团的差异，BR活性的次序是内酯型＞酮型＞脱氧型，C6上缺少酮基则无活性；C24上取代基对活性的关系是甲基＞乙基＞H，C24上有亚甲基或亚乙基的也有活性；C22、C23及C24上具有α-取向基团的化合物比β-取向的活性高，在所有的这类化合物中，油菜素内酯的活性是最高的。
就植物生理活性而言，油菜素内酯＞24-表油菜素内酯＞高油菜素内酯＞长效芸苔素内酯；无论用任何检测系统，在已知的天然的和合成的BR中，油菜素内酯是BR中活性最高的化合物。